|
Подробная информация о продукте:
|
| Имя продуктов: | qPCR | Температура хранения: | – °C 20 |
|---|---|---|---|
| Крепкий и активный для синтеза cDNA: | до 55°C. | Применение: | PCR |
| Том: | 1ml | Обратная транскрипция: | диапазон температур (42-60°C) |
| Высокий свет: | Всеобщее смешивание QPCR мастерское,Смешивание буфера QPCR разбавления шаблона мастерское,Реагент смешивания мастера QPCR биохимический |
||
qPCR зеленого цвета 2×Universal смешивание голубого GSK мастерское с буфером разбавления шаблона 40×Yellow
Введение qPCR зеленого цвета 2×Universal смешивания голубого GSK мастерского:
Этот продукт решение примикса 2x для qPCR используя метод флуоресцирования зеленого цвета I GSK химерный. Компонент ядра, полимераза ДНК Taq, жар-активированная полимераза ДНК преграженная методом антитела, который может эффектно заблокировать неспецифичную амплификацию под низкими температурными условиями. Между тем, совмещенный с буфером реакции оптимизировал для qPCR, полимераза ДНК Taq очень соответствующая для высокой реакции qPCR характерности и чувствительности. Хорошую стандартную кривую можно получить в широкой количественной области, которая точна, возпроизводима и надежна для количественного анализа генов цели. В то же время, этот продукт содержит особенную краску ссылки ROX пассивную которая соответствующая для пользы во всех аппаратурах qPCR, и никакая потребность отрегулировать концентрацию ROX на различных аппаратурах. Голубая краска добавлена в примиксе, который имеет влияние трейсера добавления образцов, и желтый разжижитель шаблона обеспечен в то же время. Когда шаблон разбавлен с желтым разжижителем шаблона и добавил в голубой примикс реакции, изменения цвета от сини к зеленому цвету, который может сыграть роль трейсера в подготовке процесса системы реакции и предотвратить утечку или misaddition. Спектры голубых и желтых красок не перекрывают с красками qPCR и не влияют на результаты реакции.
Информация о продукте qPCR зеленого цвета 2×Universal смешивания голубого GSK мастерского:
| Название продукта | Идентификация продукта | Модель |
| голубое зеленое смешивание qPCR 2×Universal мастерское с буфером разбавления шаблона 40×Yellow | GS-MBP0044-01 | 1ml |
| GS-MBP0044-05 | 5×1 mL | |
| GS-MBP0044-15 | 15×1 mL |
 |
|
Условия хранения и регуляции с голубым зеленым смешиванием qPCR 2×Universal мастерским с буфером разбавления шаблона 40×Yellow:
Влажный транспорт сумки льда; Сохраненный на температуре -20℃, действительной на 12 месяца.
Протокол/процедуры по Assay:
1. (Опционное) разбавление шаблона qPCR зеленого цвета 2×Universal смешивания голубого GSK мастерского:
Этот набор обеспечивает ЖЕЛТЫЙ буфер разбавления шаблона 40x, 40 разбавленное створками желтое разбавление шаблона которое можно использовать точно для того чтобы определить был добавлен ли шаблон к жидкости реакции qPCR путем изменение цвета жидкости. Принимать систему реакции qPCR 20ul в качестве примера, согласно количеству шаблона разбавления добавил в решение реакции qPCR 20ul, соответствуя метод разбавления первоначального шаблона можно сослаться на следующую таблицу (принимая первоначальный шаблон разбавленный к 100ul в качестве примера):
| Добавьте разбавленный шаблон к решению реакции qPCR 20ul (ul) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Добавьте буфер разбавления шаблона ЖЕЛТОГО ЦВЕТА 40x к системе разбавления шаблона 100ul (ul) | 50 | 25 | 16,7 | 12,5 | 10 | 8,4 | 7,2 | 6,3 |
| Добавьте систему разбавления шаблона 100ul к основному шаблону (ul) | x | x | x | x | x | x | x | x |
| том добавления нуклеиназы - несвязанной воды (ul) | 50-x | 75-x | 83.3-x | 87.5-x | 90-x | 91.6-x | 92.8-x | 93.7-x |
Пример:
2ul разбавило шаблон должно быть добавлено к системе реакции qPCR 20ul.
Принимающ систему разбавления шаблона 100ul в качестве примера, когда первоначальный том шаблона 20ul, добавлен буфер разбавления шаблона 25ul 40x желтый, и после этого свободная от Нуклеиназ вода 55ul добавлена к полному тому 100ul.
ЖЕЛТЫЙ БУФЕР РАЗБАВЛЕНИЯ ШАБЛОНА 40x теперь 10x. Добавьте 2ul разбавленного шаблона в буфер разбавления разбавления 20ul, и окончательный буфер разбавления шаблона ЖЕЛТОГО ЦВЕТА 40× 1x. В заключение, желтый буфер разбавления шаблона должен быть 1x в окончательной системе qPCR.
Примечание: Если шаблону не нужно быть разбавленным, или если не использован разжижитель шаблона G3362-2, то вы можете проигнорировать этот шаг.
2. Порекомендуйте систему реакции qPCR о qPCR зеленого цвета 2×Universal смешивании голубого GSK мастерском::
| Компонент | rxn 20ul | rxn 50ul | Окончательное Concentraction |
| qPCR зеленого цвета 2×Universal смешивание голубого SYBR мастерское | 10ul | 25ul | 1× |
| Передний праймер (10uM) a | 0.4ul | 1ul | 0.2uM |
| Обратный праймер (10uM) a | 0.4ul | 1ul | 0.2uM |
| Templateb | Переменная | Переменная | по мере необходимости |
| Свободная от Нуклеиназ вода | Добавьте к 20ul | Добавьте к 50ul |
a. Обычно, хорошее влияние амплификации можно получить с окончательной концентрацией 0.2um. Когда представление реакции плохо, концентрацию праймера можно отрегулировать в границах 0.2-1.0um.
b. Количество добавления шаблона меняет с числом копий гена цели в решении шаблона, и соотвествующее количество добавления шаблона обсужено разбавлением градиента. Самое лучшее количество добавлению ДНК шаблона в системе реакции 20ul было чем 100 ng. Когда cDNA (решение реакции RT) реакции RT-PCR было использовано как шаблон, количество добавлению не должно превысить 10% из полного тома решения реакции PCR.
3. Процедура по реакции PCR (смогите быть отрегулировано согласно аппаратурам):
a: Если характерности амплификации нужно быть улучшенным, то процедуру по или температуру нагрева при отжиге 2-шага можно использовать; Для того чтобы улучшить эффективность амплификации, процедуру по 3-шага или время расширения можно использовать.
Примечание:
1. Пожалуйста несите устранимые перчатки во время деятельности для избежания загрязнения рНКазы.
2. Обратные продукты транскрипции можно хранить на -20℃ на короткое время. Если долгосрочное хранение необходимо, то порекомендованы, что хранит они на -80℃ после паковать для избежания повторенных циклов замораживани-таяния.
3. Если шаблон eukaryotic начала, то порекомендованы, что выбирает Oligo (dT) праймер 18 и спаривает его с 3' поли кабель eukaryotic mRNA для того чтобы получить самый высокий выход без сокращений cDNA.
4. Для обратной транскрипции prokaryotic РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, случайный праймер Hexamer или праймер Джин специфический должны быть использованы.
5. Случайный праймер Hexamer имеет широкую применимость и соответствующий для mRNA, rRNA, tRNA, небольшой РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ и шаблонов lncRNA.
6. Если обратная транскрипция следовать assay qPCR, то Oligo (dT) праймер 18 и случайный праймер Hexamer можно смешать для того чтобы сделать эффективностью синтеза cDNA во всех регионах mRNA это же, которое помогает улучшить подлинность и повторимость количественных результатов.
7. Если последующие праймеры qPCR конструированы через exons, то шаг удаления генома можно снять.
Принципы проектирования праймера:
1. Порекомендованы, что находит длина продукта амплификации между 80-300 bp;
2. Длина праймера: 18-25 bp;
3. Содержание основания G+C в праймерах должно находиться между 40%-60%;
4. Разница в значения Tm между передними праймерами и обратными праймерами чем 2℃, и значение Tm между 58-62℃ самые лучшие;
5. Randomness низкопробного распределения;
6. Праймеры не должны содержать само-комплементарные последовательности, в противном случае они сформируют вторичную структуру hairpin;
7. Там должно быть не больше чем 4 комплементарное или гомологичные основания между 2 праймерами, в противном случае димер праймера будет сформирован, особенно комплементарное перекрытие на 3' конец;
8. Предложены, что будет 3' терминальное основание праймера g или c;
9. Никакие другие неспецифичные продукты не были найдены в результатах сравнения NCBI.
Общие проблемы и решения:
| Описание проблемы | Возможные причины | Решения |
| В конце реакции, никакая кривая усиления не появилась или значение CT появилось слишком поздно | Концентрация шаблона слишком низка | Повторите эксперимент для уменьшения многократной цепи разбавления шаблона, и начало от самой высокой концентрации когда концентрация образца неизвестна |
| Ухудшение шаблона | Шаблон был подготовлен снова и эксперимент был повторен | |
| Иы АБС битор PCR в системе | Вообще, шаблон снесен внутри, число разбавления шаблона увеличено или reprepared и повторен шаблон с особой чистотой | |
| Праймеры могут ухудшить | Праймеры которые не были использованы в течение длительного времени должны сперва быть испытаны для целостности электрофорезом СТРАНИЦЫ для того чтобы управлять вне возможностью ухудшения | |
| Низкая эффективность амплификации | ncrease концентрация праймера, пробует процедуру по амплификации 3-шага, или переконструирует праймер | |
| Продукт амплификации слишком длинен | Длина продукта амплификации была проконтролирована в границах 80-300 bp | |
| Пустой контроль показывает сигнал | Загрязнение системы реакции | Во первых, вода пустого контроля должна быть заменена. Если такая же ситуация все еще происходит, то праймеры, всасыватели и трубки PCR должны быть заменены или новое мастерское смешивание должно быть начато. Система реакции подготовлена в супер чистой таблице для уменьшения загрязнения аэрозоля |
| Неспецифичная амплификация как димеры праймера появляется |
Вообще, нормально для продуктов амплификации появиться в пустой контроль после 35 циклов, которые должны быть проанализированы с плавя кривой. Праймер переконструкции, регулирует концентрацию праймера или оптимизировать процедуру по реакции PCR |
|
| Плавя кривая имеет множественные пики | Дизайн праймера плох | Новый праймер был переконструирован согласно принципам проектирования праймера |
| Концентрация праймера слишком высока | Уменьшите концентрацию праймера соотвественно | |
| Генное загрязнение в шаблоне cDNA | Извлеченное решение РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ усвоено используя энзимы ДНК, как DSDNase, для того чтобы извлечь генное загрязнение, или конструировать праймеры transintron | |
| Плохая воспроизводимость экспериментов | Ошибка добавления образца большая |
Польза точной пипетки, с пипеткой высококачественной высоты всасывания точной; Высокий шаблон разбавления, добавляя большой шаблон тома для уменьшения ошибки выборочного обследования; Том реакции qPCR был увеличен |
| Концентрация шаблона слишком низка | Повторите эксперимент для уменьшения времен разбавления шаблона | |
| Отступление температуры на различных положениях аппаратуры qPCR | Калибрируйте аппаратуру qPCR регулярно | |
| Кривая усиления не ровна | Сигнал флуоресцирования слишком слаб, произведенный после коррекции системы |
Обеспечьте что не ухудшены краски смешанные заранее в мастерском смешивании; Замените дневной сигнал собрать лучше потребляемые вещества qPCR |
| Перерывы или выскальзывания кривой усиления | Концентрация шаблона была выше и значение критической точки базиса было больше чем значение CT | Была уменьшена была reanalyzed критическая точка базиса (значение -3 Ct) и данные |
| Кривые усиления индивидуального Wells внезапно упали остро | Пузыри в трубке реакции |
Обеспечьте что СМЕШИВАНИЕ совершенно растворено, и не завихряйтесь и не осциллируйте равномерно; После того как образец добавлен, пузыри извлекаются центрифугированием со светлой резинкой. Время пре-denaturation было продлено к минуте 10 извлечь пузыри |
Если вам нужна больше информации о qPCR зеленого цвета 2×Universal смешивании голубого GSK мастерском с буфером разбавления шаблона 40×Yellow, то пожалуйста позвольте нам знать онлайн, спасибо.
Контактное лицо: Ms. Kris Zhang
Телефон: 0086-0769-85914911
